細(xì)胞復(fù)蘇和凍存是細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的操作，主要用于保存和恢復(fù)細(xì)胞系。以下是一些基本的步驟和注意事項(xiàng)：
### 細(xì)胞凍存（Cryopreservation）
1. **細(xì)胞準(zhǔn)備**：選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，通過(guò)胰蛋白酶或EDTA等消化細(xì)胞，使其成為單個(gè)細(xì)胞懸液。
2. **細(xì)胞計(jì)數(shù)**：使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞密度。
3. **加入凍存液**：將細(xì)胞懸液與凍存液按一定比例混合，常用的凍存液含有DMSO或丙三醇等作為保護(hù)劑。
4. **分配細(xì)胞**：將細(xì)胞懸液分配到凍存管中，通常每管的細(xì)胞量是1-2mL。
5. **逐步降溫**：
- 短期保存：可以立即將凍存管放入-80°C冰箱或液氮罐中的凍存盒中。
- 長(zhǎng)期保存：通常采用程序降溫機(jī)進(jìn)行逐步降溫，以防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，造成損傷。
6. **儲(chǔ)存**：將凍存管存放在液氮罐中，溫度約為-196°C。
### 細(xì)胞復(fù)蘇（Thawing）
1. **準(zhǔn)備**：從液氮罐中取出所需的凍存管，快速轉(zhuǎn)移至37°C水浴中。
2. **解凍**：在水浴中輕輕搖動(dòng)凍存管，直到冰wan全融化。
3. **去除凍存液**：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有wan全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕混合。
4. **離心**：通常以低速（約100-200g）離心5-10分鐘，以沉淀細(xì)胞。
5. **去除上清**：小心去除上清液，避免擾動(dòng)細(xì)胞沉淀。
6. **重懸和接種**：將細(xì)胞重懸于適量的wan全培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)。
### 注意事項(xiàng)
- **無(wú)菌操作**：整個(gè)過(guò)程需在無(wú)菌條件下進(jìn)行，避免污染。
- **凍存液的選擇**：不同細(xì)胞類型可能需要不同的凍存液配方。
- **細(xì)胞密度**：凍存時(shí)細(xì)胞密度不宜過(guò)高，以免影響復(fù)蘇后的細(xì)胞活性。
- **解凍速度**：快速解凍有助于減少細(xì)胞損傷。
- **復(fù)蘇后的監(jiān)測(cè)**：復(fù)蘇后需檢查細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和污染情況。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的成功與否直接關(guān)系到細(xì)胞系的質(zhì)量和長(zhǎng)期使用的可行性，因此這些操作需要嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）。